感受態(tài)細(xì)胞的制備過程和原理
2015-6-28 9:36:47 點(diǎn)擊：
實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/b>
為了獲得很多的質(zhì)粒作為克隆載體，咱們需要將購買來的質(zhì)粒經(jīng)過轉(zhuǎn)化的辦法導(dǎo)入細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)。制備出感受態(tài)的細(xì)胞，咱們就能夠便利的將需克隆的質(zhì)粒導(dǎo)入其中，使其繁衍，就能獲得很多質(zhì)粒。本次試驗(yàn)的意圖就是添加質(zhì)粒的數(shù)量。同時(shí)，咱們能把握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化的基本原理和試驗(yàn)技術(shù)辦法。
1挑取一個(gè)JM109單菌落于3ml LB(無抗生素)培育基中，37℃，180rpm培育過夜。
[讓菌復(fù)蘇，進(jìn)入對(duì)數(shù)期的早中期。此刻更簡單制得感受態(tài)細(xì)胞。]
2取0.4mL過夜培育物參加到40mL LB(無抗生素)培育基中，37℃250rpm大概2.5小時(shí)。
[削減到達(dá)所需亮的均所需繁衍的世代數(shù)，以削減菌的變異。]
3取培育物置于40mL的滅菌離心管中，冰浴10min，4000rpm 4℃離心10min，棄上清。（將一切上清倒光，能夠?qū)㈦x心管倒過來）
[使細(xì)菌的成長中止，代謝減慢。由于這時(shí)現(xiàn)已沒有培育基了，假如細(xì)菌仍有很高的代謝功率，則有很多細(xì)菌逝世。]
4菌體重懸于10mL 100mmol/L嚴(yán)寒CaCl2中，輕吹，4℃ 30min，4000rpm離心5min棄上清。
[ 細(xì)菌處于0度，CaCl2低滲溶液中，菌細(xì)胞脹大成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸鹽混合物黏附于細(xì)胞外表（羥基來源于細(xì)胞壁上的糖，磷酸來源于DNA），經(jīng)短時(shí)間420C熱激處理，推進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。（一定要輕吹，這時(shí)細(xì)胞壁翻開，非常軟弱）]
5菌體重懸于1mL 100mmol/L嚴(yán)寒的CaCl2中，輕吹，用于轉(zhuǎn)化。
[除去一切的LB以及細(xì)胞破損后釋放出來的細(xì)胞內(nèi)含物。避免細(xì)胞分裂，致使很多細(xì)胞逝世。（一定要輕吹，這時(shí)細(xì)胞壁翻開，非常軟弱）]
6 取感受態(tài)細(xì)胞100uL，參加2uLpET-21a質(zhì)粒，冰浴30 min受體菌：感受態(tài)細(xì)胞100uL，參加2 uL無菌雙蒸水陰性對(duì)照：0.1mol/LCaCl2溶液100uL，參加2 uL陰性對(duì)照
[ 第一個(gè)陰性對(duì)照是為了驗(yàn)證LB中的抗生素有活性；第二個(gè)陰性對(duì)照是為了驗(yàn)證CaCl2溶液和pET-21a質(zhì)粒未被污染。]
[冰浴是為了降低細(xì)胞代謝率，避免細(xì)胞很多逝世。]
7 熱激 42度，90s
【在低溫處理后，熱激，能夠使細(xì)胞壁熱脹冷縮，再低溫，使細(xì)胞壁上黏附的質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)�！�
8冰浴2 min
9參加800 uL 無抗生素的 LB，37℃復(fù)蘇1h
【用LB復(fù)蘇細(xì)胞，使細(xì)胞康復(fù)活力，從而使細(xì)胞中的質(zhì)粒表達(dá)抗抗生素的基因，只要這樣才能使轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌在有抗生素的LB平板上成長。】
10 取100ul細(xì)胞直接在含50ug/mL Carbenicillin(羧芐西林)的LB培育基上鋪平板，將平皿放置37 oC溫箱30min至液體被吸收。倒置平皿37 oC培育過夜，出現(xiàn)菌落。
【 這些菌落為轉(zhuǎn)化成功的菌落，而對(duì)照組應(yīng)當(dāng)沒有菌落。在意圖菌落的旁邊有也許出現(xiàn)衛(wèi)星菌落，這是由于畝的菌落的抗性基因似的菌落周圍的抗生素失效，長出了轉(zhuǎn)化為成功的菌落。用羧芐西林因其對(duì)酸安穩(wěn)、不易被細(xì)菌降解，所以能夠降低衛(wèi)星菌落的數(shù)量。
由于抗生素高溫易失活，所以應(yīng)比及LB600C時(shí)（熱而不燙），參加抗生素�！�
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