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WB技術(shù)常見(jiàn)問(wèn)題分析

2020-2-11 16:04:02      點(diǎn)擊:
樣品制備

問(wèn)題

可能原因

驗(yàn)證或解決辦法

樣品中有粘粘糊糊的東西

DNA從破碎的細(xì)胞中釋放出來(lái)

可以用酶,或機(jī)械方式將它打斷

加入上樣緩沖液后,樣品偏黃綠色

樣品的PH不對(duì)

使用緩沖液平衡PH值


制膠

問(wèn)題

可能原因

驗(yàn)證或解決辦法

膠不平

膠板上有雜質(zhì)

膠板洗刷干凈

APS和TEMED過(guò)量

加入合適量的APS和TEMED

混合不均勻

加入試劑后搖勻,使其充分混合,防止部分膠塊聚合不均勻

受熱不均勻?qū)е履z聚合不均勻

降低室溫

凝膠

漏液

膠板上有雜質(zhì)

膠板洗刷干凈

底部漏液

對(duì)齊兩塊玻璃板底部

玻璃板是否有破損

更換玻璃板


電泳

問(wèn)題

可能原因

驗(yàn)證或解決辦法

“微笑”

“倒微笑”

條帶

凝膠聚合不均勻

凝膠過(guò)快

拔梳子時(shí)不要破壞加樣孔

清洗加樣孔時(shí)破壞了加樣孔

樣品鹽濃度過(guò)高會(huì)擠壓其他條帶導(dǎo)致寬窄不一

膠板底部有氣泡會(huì)影響電泳

電泳時(shí)電流太大

電泳時(shí)溫度過(guò)高

灌膠時(shí)候盡量混合均勻

聚合不能太快

拔梳子及清洗加樣孔要小心

純化樣品,調(diào)整鹽濃度

應(yīng)趕走氣泡

減小電壓電流

降溫

條帶

扭曲

條帶

模糊

條帶比

正常的窄



蛋白轉(zhuǎn)印

問(wèn)題

可能原因

驗(yàn)證或解決辦法

凝膠腫脹或卷曲

凝膠內(nèi)的液體不平衡

可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10min

條帶歪斜或漂移

長(zhǎng)期使用導(dǎo)致海綿變薄,“三明治”結(jié)構(gòu)不緊湊導(dǎo)致。

可在兩塊海綿之間墊上少許普通的濾紙

單個(gè)或多個(gè)白點(diǎn)

氣泡阻礙了電流

確保膜和膠塊之間沒(méi)有氣泡

轉(zhuǎn)膜緩沖液過(guò)熱

緩沖液中離子濃度太低,電流或電壓太高。

轉(zhuǎn)膜過(guò)程注意降溫

轉(zhuǎn)膜

不充分

膜沒(méi)有完全均勻濕透

使用100% methanol浸透膜

靶蛋白分子量小于10,000

選擇小孔徑的膜,縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間

靶蛋白等電點(diǎn)等于或接近轉(zhuǎn)移緩沖液pH值

可嘗試使用其他緩沖液如CAPS緩沖液(pH 10.5)或使用低pH值緩沖液如乙酸緩沖液

甲醇濃度過(guò)高

過(guò)高甲醇濃度會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)與SDS分離,從而沉淀在凝膠中,同時(shí)會(huì)使凝膠收縮或變硬,從而抑制高分子量蛋白的轉(zhuǎn)移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替

轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠Thick gel

對(duì)于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間




其他

問(wèn)題

可能原因

驗(yàn)證或解決辦法

背景高

膜沒(méi)有完全均勻濕透

使用100% methanol浸透膜

洗膜不充分

增加洗液體積和洗滌次數(shù)

阻斷不充分

增加封閉液孵育時(shí)間,或者提高溫度。選擇合適的封閉試劑(脫脂奶粉,BSA,酪蛋白等)

二抗?jié)舛冗^(guò)高

降低二抗?jié)舛?/span>

檢測(cè)過(guò)程中膜干燥

保證充分的反應(yīng)液,避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象

曝光過(guò)度

縮短曝光時(shí)間

抗體與阻斷蛋白有交叉反應(yīng)

檢測(cè)抗體與阻斷蛋白的交叉反應(yīng)性,選擇無(wú)交叉反應(yīng)的封閉劑。洗滌液中加入Tween-20可減少交叉反應(yīng)

沒(méi)有

陽(yáng)性條帶

抗體染色不充分

增加抗體濃度,延長(zhǎng)孵育時(shí)間

酶失活

直接將酶和底物進(jìn)行混合,如果不顯色則說(shuō)明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物

標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低

設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照,如果陽(yáng)性對(duì)照有結(jié)果,但標(biāo)本沒(méi)有則可能是標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考慮增加標(biāo)本上樣量解決靶蛋白含量低的原因。

試劑不匹配

一抗與組織種屬,一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間不匹配。通過(guò)設(shè)置內(nèi)參照可以驗(yàn)證二級(jí)檢測(cè)系統(tǒng)的有效性

一抗失效

選擇在有效期內(nèi)抗體;并選擇現(xiàn)配現(xiàn)用的工作液

HRP抑制劑

所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉

有陽(yáng)性條帶,但條帶比較弱

抗體染色不充分

增加抗體濃度,延長(zhǎng)孵育時(shí)間

酶活性降低

直接將酶和底物進(jìn)行混合,如果不顯色則說(shuō)明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物

標(biāo)本中靶蛋白含量太低

增加標(biāo)本上樣量

洗膜過(guò)度

縮短洗滌時(shí)間

HRP抑制劑

所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉

抗體活性降低

選擇在有效期內(nèi)的抗體,工作液現(xiàn)配現(xiàn)用,避免長(zhǎng)時(shí)間放置

蛋白轉(zhuǎn)移不充分

見(jiàn)上述

封閉過(guò)度

減少封閉劑的量或縮短時(shí)間;換用不同封閉劑類型

曝光時(shí)間過(guò)短

延長(zhǎng)曝光時(shí)間

HRP抑制劑

所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉

條帶位置(大。┎粚(duì);或有非特異性條帶

二抗的非特異性結(jié)合

增加一個(gè)對(duì)照:不加一抗,其他操作過(guò)程不變,即可驗(yàn)證背景是否由二抗系統(tǒng)來(lái)源。選擇其他二抗(特異性更強(qiáng)的,只針對(duì)重鏈的)

一抗的特異性不夠

使用單克隆或者親和純化的抗體,保證抗體的特異性

蛋白降解

使用新鮮制備的標(biāo)本,并使用蛋白酶抑制劑

二聚體或多聚體存在

增加蛋白質(zhì)變性過(guò)程及強(qiáng)度

抗體濃度過(guò)高

降低抗體(一抗、二抗)濃度,可以減少非特異性條帶

蛋白上樣量過(guò)大

降低上樣量

背景

有斑點(diǎn)

封閉劑中有聚集體

使用前過(guò)濾封閉試劑

HRP耦聯(lián)二抗中有聚集體

過(guò)濾二抗試劑,去除聚集體

膜上出現(xiàn)反像(暗背景上白色帶)

HRP含量過(guò)高

降低酶聯(lián)二抗的濃度