WB技術(shù)常見(jiàn)問(wèn)題分析
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問(wèn)題 |
可能原因 |
驗(yàn)證或解決辦法 |
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樣品中有粘粘糊糊的東西 |
DNA從破碎的細(xì)胞中釋放出來(lái) |
可以用酶，或機(jī)械方式將它打斷 |
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加入上樣緩沖液后，樣品偏黃綠色 |
樣品的PH不對(duì) |
使用緩沖液平衡PH值 |
制膠
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問(wèn)題 |
可能原因 |
驗(yàn)證或解決辦法 |
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膠不平 |
膠板上有雜質(zhì) |
膠板洗刷干凈 |
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APS和TEMED過(guò)量 |
加入合適量的APS和TEMED |
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混合不均勻 |
加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻 |
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受熱不均勻?qū)е履z聚合不均勻 |
降低室溫 |
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凝膠 漏液 |
膠板上有雜質(zhì) |
膠板洗刷干凈 |
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底部漏液 |
對(duì)齊兩塊玻璃板底部 |
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玻璃板是否有破損 |
更換玻璃板 |
電泳
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問(wèn)題 |
可能原因 |
驗(yàn)證或解決辦法 |
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“微笑” 或 “倒微笑” 條帶 |
凝膠聚合不均勻 凝膠過(guò)快 拔梳子時(shí)不要破壞加樣孔 清洗加樣孔時(shí)破壞了加樣孔 樣品鹽濃度過(guò)高會(huì)擠壓其他條帶導(dǎo)致寬窄不一 膠板底部有氣泡會(huì)影響電泳 電泳時(shí)電流太大 電泳時(shí)溫度過(guò)高 |
灌膠時(shí)候盡量混合均勻 聚合不能太快 拔梳子及清洗加樣孔要小心 純化樣品，調(diào)整鹽濃度 應(yīng)趕走氣泡 減小電壓電流 降溫 |
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條帶 扭曲 |
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條帶 模糊 |
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條帶比 正常的窄 |
蛋白轉(zhuǎn)印
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問(wèn)題 |
可能原因 |
驗(yàn)證或解決辦法 |
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凝膠腫脹或卷曲 |
凝膠內(nèi)的液體不平衡 |
可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10min |
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條帶歪斜或漂移 |
長(zhǎng)期使用導(dǎo)致海綿變薄，“三明治”結(jié)構(gòu)不緊湊導(dǎo)致。 |
可在兩塊海綿之間墊上少許普通的濾紙 |
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單個(gè)或多個(gè)白點(diǎn) |
氣泡阻礙了電流 |
確保膜和膠塊之間沒(méi)有氣泡 |
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轉(zhuǎn)膜緩沖液過(guò)熱 |
緩沖液中離子濃度太低，電流或電壓太高。 |
轉(zhuǎn)膜過(guò)程注意降溫 |
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轉(zhuǎn)膜 不充分 |
膜沒(méi)有完全均勻濕透 |
使用100% methanol浸透膜 |
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靶蛋白分子量小于10,000 |
選擇小孔徑的膜，縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間 |
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靶蛋白等電點(diǎn)等于或接近轉(zhuǎn)移緩沖液pH值 |
可嘗試使用其他緩沖液如CAPS緩沖液（pH 10.5)或使用低pH值緩沖液如乙酸緩沖液 |
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甲醇濃度過(guò)高 |
過(guò)高甲醇濃度會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)與SDS分離，從而沉淀在凝膠中，同時(shí)會(huì)使凝膠收縮或變硬，從而抑制高分子量蛋白的轉(zhuǎn)移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替 |
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轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠Thick gel |
對(duì)于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間 |
其他
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問(wèn)題 |
可能原因 |
驗(yàn)證或解決辦法 |
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背景高 |
膜沒(méi)有完全均勻濕透 |
使用100% methanol浸透膜 |
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洗膜不充分 |
增加洗液體積和洗滌次數(shù) |
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阻斷不充分 |
增加封閉液孵育時(shí)間，或者提高溫度。選擇合適的封閉試劑（脫脂奶粉，BSA，酪蛋白等） |
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二抗?jié)舛冗^(guò)高 |
降低二抗?jié)舛?/span> |
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檢測(cè)過(guò)程中膜干燥 |
保證充分的反應(yīng)液，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象 |
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曝光過(guò)度 |
縮短曝光時(shí)間 |
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抗體與阻斷蛋白有交叉反應(yīng) |
檢測(cè)抗體與阻斷蛋白的交叉反應(yīng)性，選擇無(wú)交叉反應(yīng)的封閉劑。洗滌液中加入Tween-20可減少交叉反應(yīng) |
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沒(méi)有 陽(yáng)性條帶 |
抗體染色不充分 |
增加抗體濃度，延長(zhǎng)孵育時(shí)間 |
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酶失活 |
直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說(shuō)明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物 |
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標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 |
設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，如果陽(yáng)性對(duì)照有結(jié)果，但標(biāo)本沒(méi)有則可能是標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考慮增加標(biāo)本上樣量解決靶蛋白含量低的原因。 |
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試劑不匹配 |
一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間不匹配。通過(guò)設(shè)置內(nèi)參照可以驗(yàn)證二級(jí)檢測(cè)系統(tǒng)的有效性 |
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一抗失效 |
選擇在有效期內(nèi)抗體；并選擇現(xiàn)配現(xiàn)用的工作液 |
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HRP抑制劑 |
所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉 |
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有陽(yáng)性條帶，但條帶比較弱 |
抗體染色不充分 |
增加抗體濃度，延長(zhǎng)孵育時(shí)間 |
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酶活性降低 |
直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說(shuō)明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物 |
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標(biāo)本中靶蛋白含量太低 |
增加標(biāo)本上樣量 |
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洗膜過(guò)度 |
縮短洗滌時(shí)間 |
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HRP抑制劑 |
所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉 |
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抗體活性降低 |
選擇在有效期內(nèi)的抗體，工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，避免長(zhǎng)時(shí)間放置 |
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蛋白轉(zhuǎn)移不充分 |
見(jiàn)上述 |
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封閉過(guò)度 |
減少封閉劑的量或縮短時(shí)間；換用不同封閉劑類型 |
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曝光時(shí)間過(guò)短 |
延長(zhǎng)曝光時(shí)間 |
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HRP抑制劑 |
所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉 |
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條帶位置（大�。┎粚�(duì)；或有非特異性條帶 |
二抗的非特異性結(jié)合 |
增加一個(gè)對(duì)照：不加一抗，其他操作過(guò)程不變，即可驗(yàn)證背景是否由二抗系統(tǒng)來(lái)源。選擇其他二抗（特異性更強(qiáng)的，只針對(duì)重鏈的） |
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一抗的特異性不夠 |
使用單克隆或者親和純化的抗體，保證抗體的特異性 |
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蛋白降解 |
使用新鮮制備的標(biāo)本，并使用蛋白酶抑制劑 |
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二聚體或多聚體存在 |
增加蛋白質(zhì)變性過(guò)程及強(qiáng)度 |
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抗體濃度過(guò)高 |
降低抗體（一抗、二抗）濃度，可以減少非特異性條帶 |
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蛋白上樣量過(guò)大 |
降低上樣量 |
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背景 有斑點(diǎn) |
封閉劑中有聚集體 |
使用前過(guò)濾封閉試劑 |
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HRP耦聯(lián)二抗中有聚集體 |
過(guò)濾二抗試劑，去除聚集體 |
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膜上出現(xiàn)反像（暗背景上白色帶） |
HRP含量過(guò)高 |
降低酶聯(lián)二抗的濃度 |
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