組織和白細(xì)胞中基因組DNA的提取
2015-6-28 9:45:34 點(diǎn)擊：
一、 目的
掌握真核生物基因組DNA的提取方法。
二、 原理
高產(chǎn)量和高純度的真核生物DNA分離技術(shù)是進(jìn)行PCR、Southern雜交、DNA文庫(kù)構(gòu)建，及許多其它分子生物學(xué)研究的前提條件。真核生物基因組DNA位于細(xì)胞核內(nèi)，與細(xì)胞核蛋白結(jié)合在一起。要提取真核細(xì)胞基因組DNA，必須去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)、多糖、脂類(lèi)以及RNA等生物大分子。采用組織勻漿法破碎細(xì)胞，在SDS和EDTA溶液中，以蛋白酶K消化細(xì)胞的蛋白質(zhì)。該方法雖然傳統(tǒng)、簡(jiǎn)單，但卻行之有效；不僅實(shí)驗(yàn)操作具有相當(dāng)大的靈活性，而且不需昂貴的儀器設(shè)備。其中SDS能破壞核膜使DNA釋放入水溶液，還可破壞細(xì)胞膜上的脂肪和蛋白質(zhì)，并與蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物從而使蛋白質(zhì)變性沉淀；EDTA螯合Mg2+, Ca2+等金屬離子，抑制DNA酶對(duì)DNA的降解作用。這樣大分子DNA在乙醇中便以絮狀物析出，離心沉淀后再用70%的乙醇洗滌除鹽，干燥后溶于TE或雙蒸水中。以此法制備的DNA大小一般為40～150kb。
三、 儀器材料
（一）儀器
1．恒溫水浴鍋（北京醫(yī)療設(shè)備廠，型號(hào)：BS2-I）
2．高速離心機(jī)（Hema，型號(hào)：TGL-16H）
3．冷凍高速離心機(jī)（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：TGL-18R）
4．-20℃冰箱（海爾集團(tuán)青島電冰柜總廠 型號(hào)：BD-198S）
5．液氮罐（成都液氮容器廠，型號(hào)：YDS-35-125）
6．勻漿器
7．自動(dòng)制冰機(jī) (意大利SCOTSMAN公司 型號(hào)：AF-10)
（二）材料
1. 動(dòng)物或人的組織標(biāo)本
2. 人的血液標(biāo)本
四、 試劑
1. DNA抽提緩沖液：
1.0 mol/L Tris-HCl (pH8.0) 50 ml
0.5mol/L EDTA (pH8.0) 2.0 ml
1.0M NaCl 100ml
10% SDS 50 ml
水 298ml
2．液氮
3．蛋白酶K（20mg/ml）：0.2g蛋白酶K溶于10ml水中。工作濃度100－200μg/ml。
4．平衡酚
5．氯仿
6．3M乙酸鈉（pH4.8）：稱(chēng)取40.81g三水乙酸鈉溶于80.0ml水中，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至4.8，定容至100ml。
7．預(yù)冷的100%乙醇
8．預(yù)冷的70%乙醇
9. 預(yù)冷的0.01M的PBS
五、方法
(一) 組織細(xì)胞基因組DNA的提取
1. 取新鮮組織或冰凍組織塊0.3-0.5cm3，盡量剪碎，加DNA抽提緩沖液400μl，在組織勻漿器中勻漿至不見(jiàn)組織塊，轉(zhuǎn)入1.5ml Ep管中，用100μl DNA抽提緩沖液沖洗勻漿器，沖洗液一并轉(zhuǎn)入Ep管中。
2. 加入蛋白酶K至終濃度100-200μg/ml，混勻后放于37℃水浴5-12h，中間振搖數(shù)次。
3. 加500μl（等體積）平衡酚，顛倒混勻30s，10,000rpm離心1min，小心取出上層水相450μl，移入一新的Ep管，必要時(shí)重復(fù)抽提一次。
4. 向水相管中加入500μl氯仿，顛倒混勻30s，10,000rpm離心1min。
5. 小心取出上層水相400μl，移入另一新的Ep管，加入60μl 3M NaAc（pH4.8）和1000μl的冰無(wú)水乙醇，輕輕顛倒混勻，即可見(jiàn)或多或少的云絮狀漂浮物。-20℃放置2h。
6. 以14,000rpm冷凍離心15min，輕輕棄去上清，用預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀。
7. 待沉淀干燥后，加適量的TE或雙蒸水溶解，-20℃或4℃保存?zhèn)溆谩?/span>
8. 取5μl DNA溶液溶于495μl雙蒸水中，混勻，測(cè)定其在260nm和280nm處的吸光度值。
DNA含量（mg/ml）=A260×5
（二）白細(xì)胞基因組DNA的提取
1. 收集5～10ml抗凝血，3000rpm離心10min，棄去上層淡黃色的血漿，小心吸取白細(xì)胞層。
2. 用雙蒸水洗滌白細(xì)胞，使混雜的紅細(xì)胞溶血，3000rpm×10min離心數(shù)次，以去除紅細(xì)胞。
3. 收集白細(xì)胞沉淀，以適量雙蒸水或PBS重懸白細(xì)胞，移入1.5ml的離心管中，每管0.25ml。
4. 加入等體積（0.25ml）的2×DNA抽提緩沖液，加蛋白酶K至終濃度100～200μg/ml，混勻后放于37℃水浴2～5h。
5. 加500μl（等體積）平衡酚，顛倒混勻30s，10,000rpm離心1min，小心取出上層水相450μl，移入一新的1.5ml Ep管，必要時(shí)重復(fù)抽提一次。
6. 向水相管中加入500μl氯仿，顛倒混勻30s，10,000rpm離心1min。
7. 小心取出上層水相400μl，移入另一新的Ep管，加入60μl 3M NaAc（pH4.8）和1000μl的冰無(wú)水乙醇，輕輕顛倒混勻，即可見(jiàn)或多或少的云絮狀漂浮物。-20℃放置2h。
8. 以14,000rpm冷凍離心15min，輕輕棄去上清，用預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀。
9. 待沉淀干燥后，加適量的TE或雙蒸水溶解，-20℃或4℃保存?zhèn)溆谩?/span>
10. 取5μl DNA溶液溶于495μl雙蒸水中，混勻，測(cè)定其在260nm和280nm處的吸光度值。DNA含量（mg/ml）= A260×稀釋倍數(shù)/20=A260×5
六、結(jié)果
0.5%的瓊脂糖凝膠（加入溴化乙錠至終濃度0.5μg/ml）電泳，即可見(jiàn)熒光顯色的DNA條帶。
七、注意事項(xiàng)
1. 組織塊取材應(yīng)盡量新鮮，應(yīng)在盡可能剪碎后進(jìn)行勻漿。所用勻漿器須配套適中，過(guò)大過(guò)小均不利于研磨組織塊。
2. 蛋白酶K應(yīng)盡量新鮮配制，在正式使用前應(yīng)做預(yù)試驗(yàn)以明確其活性。
3. 在進(jìn)行平衡酚、氯仿抽提時(shí)，應(yīng)盡量避免吸取蛋白質(zhì)，以免影響DNA的純度。
4. DNA沉淀不能抽得太干，否則極難溶解。稍加熱可促進(jìn)DNA的溶解。
掌握真核生物基因組DNA的提取方法。
二、 原理
高產(chǎn)量和高純度的真核生物DNA分離技術(shù)是進(jìn)行PCR、Southern雜交、DNA文庫(kù)構(gòu)建，及許多其它分子生物學(xué)研究的前提條件。真核生物基因組DNA位于細(xì)胞核內(nèi)，與細(xì)胞核蛋白結(jié)合在一起。要提取真核細(xì)胞基因組DNA，必須去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)、多糖、脂類(lèi)以及RNA等生物大分子。采用組織勻漿法破碎細(xì)胞，在SDS和EDTA溶液中，以蛋白酶K消化細(xì)胞的蛋白質(zhì)。該方法雖然傳統(tǒng)、簡(jiǎn)單，但卻行之有效；不僅實(shí)驗(yàn)操作具有相當(dāng)大的靈活性，而且不需昂貴的儀器設(shè)備。其中SDS能破壞核膜使DNA釋放入水溶液，還可破壞細(xì)胞膜上的脂肪和蛋白質(zhì)，并與蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物從而使蛋白質(zhì)變性沉淀；EDTA螯合Mg2+, Ca2+等金屬離子，抑制DNA酶對(duì)DNA的降解作用。這樣大分子DNA在乙醇中便以絮狀物析出，離心沉淀后再用70%的乙醇洗滌除鹽，干燥后溶于TE或雙蒸水中。以此法制備的DNA大小一般為40～150kb。
三、 儀器材料
（一）儀器
1．恒溫水浴鍋（北京醫(yī)療設(shè)備廠，型號(hào)：BS2-I）
2．高速離心機(jī)（Hema，型號(hào)：TGL-16H）
3．冷凍高速離心機(jī)（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：TGL-18R）
4．-20℃冰箱（海爾集團(tuán)青島電冰柜總廠 型號(hào)：BD-198S）
5．液氮罐（成都液氮容器廠，型號(hào)：YDS-35-125）
6．勻漿器
7．自動(dòng)制冰機(jī) (意大利SCOTSMAN公司 型號(hào)：AF-10)
（二）材料
1. 動(dòng)物或人的組織標(biāo)本
2. 人的血液標(biāo)本
四、 試劑
1. DNA抽提緩沖液：
1.0 mol/L Tris-HCl (pH8.0) 50 ml
0.5mol/L EDTA (pH8.0) 2.0 ml
1.0M NaCl 100ml
10% SDS 50 ml
水 298ml
2．液氮
3．蛋白酶K（20mg/ml）：0.2g蛋白酶K溶于10ml水中。工作濃度100－200μg/ml。
4．平衡酚
5．氯仿
6．3M乙酸鈉（pH4.8）：稱(chēng)取40.81g三水乙酸鈉溶于80.0ml水中，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至4.8，定容至100ml。
7．預(yù)冷的100%乙醇
8．預(yù)冷的70%乙醇
9. 預(yù)冷的0.01M的PBS
五、方法
(一) 組織細(xì)胞基因組DNA的提取
1. 取新鮮組織或冰凍組織塊0.3-0.5cm3，盡量剪碎，加DNA抽提緩沖液400μl，在組織勻漿器中勻漿至不見(jiàn)組織塊，轉(zhuǎn)入1.5ml Ep管中，用100μl DNA抽提緩沖液沖洗勻漿器，沖洗液一并轉(zhuǎn)入Ep管中。
2. 加入蛋白酶K至終濃度100-200μg/ml，混勻后放于37℃水浴5-12h，中間振搖數(shù)次。
3. 加500μl（等體積）平衡酚，顛倒混勻30s，10,000rpm離心1min，小心取出上層水相450μl，移入一新的Ep管，必要時(shí)重復(fù)抽提一次。
4. 向水相管中加入500μl氯仿，顛倒混勻30s，10,000rpm離心1min。
5. 小心取出上層水相400μl，移入另一新的Ep管，加入60μl 3M NaAc（pH4.8）和1000μl的冰無(wú)水乙醇，輕輕顛倒混勻，即可見(jiàn)或多或少的云絮狀漂浮物。-20℃放置2h。
6. 以14,000rpm冷凍離心15min，輕輕棄去上清，用預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀。
7. 待沉淀干燥后，加適量的TE或雙蒸水溶解，-20℃或4℃保存?zhèn)溆谩?/span>
8. 取5μl DNA溶液溶于495μl雙蒸水中，混勻，測(cè)定其在260nm和280nm處的吸光度值。
DNA含量（mg/ml）=A260×5
（二）白細(xì)胞基因組DNA的提取
1. 收集5～10ml抗凝血，3000rpm離心10min，棄去上層淡黃色的血漿，小心吸取白細(xì)胞層。
2. 用雙蒸水洗滌白細(xì)胞，使混雜的紅細(xì)胞溶血，3000rpm×10min離心數(shù)次，以去除紅細(xì)胞。
3. 收集白細(xì)胞沉淀，以適量雙蒸水或PBS重懸白細(xì)胞，移入1.5ml的離心管中，每管0.25ml。
4. 加入等體積（0.25ml）的2×DNA抽提緩沖液，加蛋白酶K至終濃度100～200μg/ml，混勻后放于37℃水浴2～5h。
5. 加500μl（等體積）平衡酚，顛倒混勻30s，10,000rpm離心1min，小心取出上層水相450μl，移入一新的1.5ml Ep管，必要時(shí)重復(fù)抽提一次。
6. 向水相管中加入500μl氯仿，顛倒混勻30s，10,000rpm離心1min。
7. 小心取出上層水相400μl，移入另一新的Ep管，加入60μl 3M NaAc（pH4.8）和1000μl的冰無(wú)水乙醇，輕輕顛倒混勻，即可見(jiàn)或多或少的云絮狀漂浮物。-20℃放置2h。
8. 以14,000rpm冷凍離心15min，輕輕棄去上清，用預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀。
9. 待沉淀干燥后，加適量的TE或雙蒸水溶解，-20℃或4℃保存?zhèn)溆谩?/span>
10. 取5μl DNA溶液溶于495μl雙蒸水中，混勻，測(cè)定其在260nm和280nm處的吸光度值。DNA含量（mg/ml）= A260×稀釋倍數(shù)/20=A260×5
六、結(jié)果
0.5%的瓊脂糖凝膠（加入溴化乙錠至終濃度0.5μg/ml）電泳，即可見(jiàn)熒光顯色的DNA條帶。
七、注意事項(xiàng)
1. 組織塊取材應(yīng)盡量新鮮，應(yīng)在盡可能剪碎后進(jìn)行勻漿。所用勻漿器須配套適中，過(guò)大過(guò)小均不利于研磨組織塊。
2. 蛋白酶K應(yīng)盡量新鮮配制，在正式使用前應(yīng)做預(yù)試驗(yàn)以明確其活性。
3. 在進(jìn)行平衡酚、氯仿抽提時(shí)，應(yīng)盡量避免吸取蛋白質(zhì)，以免影響DNA的純度。
4. DNA沉淀不能抽得太干，否則極難溶解。稍加熱可促進(jìn)DNA的溶解。
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