基因定點(diǎn)突變
2015-6-28 9:47:32 點(diǎn)擊：
一、定點(diǎn)突變的目的
把目的基因上面的一個(gè)堿基換成另外一個(gè)堿基。
二、定點(diǎn)突變的原理
通過(guò)設(shè)計(jì)引物，并利用PCR將模板擴(kuò)增出來(lái)，然后去掉模板，剩下來(lái)的就是我們的PCR產(chǎn)物，在PCR產(chǎn)物上就已經(jīng)把這個(gè)點(diǎn)變過(guò)來(lái)了，然后再轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性克隆，再測(cè)序確定就行了。
三、引物設(shè)計(jì)原則
引物設(shè)計(jì)的一般原則不再重復(fù)。
突變引物設(shè)計(jì)的特殊原則：
（1）通常引物長(zhǎng)度為25~45 bp，我們建議引物長(zhǎng)度為30~35 bp。一般都是以要突變的堿基為中心，加上兩邊的一段序列，兩邊長(zhǎng)度至少為11-12 bp。若兩邊引物太短了，很可能會(huì)造成突變實(shí)驗(yàn)失敗，因?yàn)橐镏辽僖?1-12個(gè)bp才能與模板搭上，而這種突變PCR要求兩邊都能與引物搭上，所以?xún)蛇呑詈酶髟O(shè)至少12個(gè)bp，并且合成多一條反向互補(bǔ)的引物。
（2）如果設(shè)定的引物長(zhǎng)度為30 bp，接下來(lái)需要計(jì)算引物的Tm值，看是否達(dá)到78℃（GC含量應(yīng)大于40%）。
（3）如果Tm值低于78℃，則適當(dāng)改變引物的長(zhǎng)度以使其Tm值達(dá)到78℃（GC含量應(yīng)大于40%）。
（4）設(shè)計(jì)上下游引物時(shí)確保突變點(diǎn)在引物的中央位置。
（5）最好使用經(jīng)過(guò)純化的引物。
Tm值計(jì)算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5
注：L：引物堿基數(shù)；% of GC：引物GC含量。
四、引物設(shè)計(jì)實(shí)例
以GCG→ACG為例：
5’-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3’
（1）首先設(shè)計(jì)30 bp長(zhǎng)的上下游引物，并將A (T)設(shè)計(jì)在引物的中央位置。
Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3’
Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3’
（2）引物GC含量為40%，L為30，將這兩個(gè)數(shù)值帶入Tm值計(jì)算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。通過(guò)計(jì)算可以看出其Tm低于78℃，這樣的引物是不合適的，所以必須調(diào)整引物長(zhǎng)度。
（3）重新調(diào)整引物長(zhǎng)度。
Primer #1: 5’-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3’
Primer #2: 5’-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3’
在引物兩端加5mer（斜體下劃線處），這樣引物的GC含量為45.7%，L值為35，將這兩個(gè)數(shù)值帶入Tm值計(jì)算公式，得到其Tm為80.952（Tm=0.41×47.5-675/35+81.5），這樣的引物就可以用于突變實(shí)驗(yàn)了。
五、突變所用聚合酶及Buffer
引物和質(zhì)粒都準(zhǔn)備好后，當(dāng)然就是做PCR嘍，不過(guò)對(duì)于PCR的酶和buffer，不能用平時(shí)的，我們做PCR把整個(gè)質(zhì)粒擴(kuò)出來(lái)，延伸長(zhǎng)度達(dá)到幾個(gè)K，所以要用那些GC buffer或擴(kuò)增長(zhǎng)片段的buffer，另外，要用保真性能較好的PFU酶來(lái)擴(kuò)增，防止引進(jìn)新的突變。
除了使用基因定點(diǎn)突變?cè)噭┖�，如Stratagene和塞百盛的試劑盒，但價(jià)格昂貴。可以使用高保真的聚合酶，如博大泰克的金牌快速taq酶、Takara的PrimeSTARTM HS DNA polymerase。
六、如何去掉PCR產(chǎn)物
最簡(jiǎn)單的方法就是用DpnI酶，DpnI能夠識(shí)別甲基化位點(diǎn)并將其酶切，我們用的模板一般都是雙鏈超螺旋質(zhì)粒，從大腸桿菌里提出來(lái)的質(zhì)粒一般都被甲基化保護(hù)起來(lái)（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR產(chǎn)物都是沒(méi)有甲基化的，所以DpnI酶能夠特異性地切割模板（質(zhì)粒）而不會(huì)影響PCR產(chǎn)物，從而去掉模板留下PCR產(chǎn)物，所以提質(zhì)粒時(shí)那些菌株一定不能是甲基化缺陷株。
DpnI處理的時(shí)間最好長(zhǎng)一點(diǎn)，最少一個(gè)小時(shí)吧，最好能有兩三個(gè)小時(shí)，因?yàn)槿绻０逄幚淼貌桓蓛�，哪怕只有那么一點(diǎn)點(diǎn)，模板直接在平板上長(zhǎng)出來(lái)，就會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。
七、如何拿到質(zhì)粒
直接把通過(guò)DpnI處理的PCR產(chǎn)物拿去做轉(zhuǎn)化就行了，然后再篩選出陽(yáng)性克隆，并提出質(zhì)粒，拿去測(cè)序，驗(yàn)證突變結(jié)果。
八、圖示
九、定點(diǎn)突變操作步驟
[A] 誘導(dǎo)突變基因（PCR反應(yīng)）以待突變的質(zhì)粒為模板，用設(shè)計(jì)的引物及Muta-direct™酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，誘導(dǎo)目的基因突變。
1. 設(shè)計(jì)點(diǎn)突變引物。
[注]參考引物設(shè)計(jì)指導(dǎo)
2. 準(zhǔn)備模板質(zhì)粒DN A
[注]用dam+型菌株（例如DH5α菌株）作為宿主菌。在end+型菌株中常有克隆數(shù)低的現(xiàn)象，但是對(duì)突變效率沒(méi)有影響。提取質(zhì)粒DNA時(shí)我們建議您使用本公司的質(zhì)粒提純?cè)噭┖小?/span>
3. [選項(xiàng)]對(duì)照反應(yīng)體系（50μl反應(yīng)體系）
10×Reaction Buffer 5μl
pUC18 control plasmid（10ng/μl，total 20ng） 2μl
Control primer mix（20pmol/μl） 2μl
dNTP mixture（each 2.5mM） 2μl
dH2O 38μl
Muta-direct™ Enzyme 1μl
4. 樣品反應(yīng)體系（50μl反應(yīng)體系）
10×Reaction Buffer 5μl
Sample plasmid（10ng/μl，total 20ng） 2μl
Sample primer (F)（10pmol/μl） 1μl
Sample primer (R)（10pmol/μl） 1μl
dNTP mixture（each 2.5mM） 2μl
dH2O 38μl
Muta-direct™ Enzyme 1μl
5. PCR反應(yīng)條件
[注]按如下參數(shù)設(shè)置PCR擴(kuò)增條件。
Cycles Temperature Reaction Time
1cycle 95℃ 30sec
15cycle 95℃ 30sec
55℃ 1min
72℃ 1min per plasmid Kb
6. PCR擴(kuò)增反應(yīng)完成后冰育5分鐘，然后置于室溫（避免反復(fù)凍融）。
[注] 按下列提供的PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增，控制PCR循環(huán)數(shù)。注意當(dāng)突變點(diǎn)位點(diǎn)超過(guò)4個(gè)時(shí)會(huì)發(fā)生突變率降低的現(xiàn)象。
Mutation Cycles
1~2Nucleotide 15cycles
3Nucleotides 18cycles
[B] 突變質(zhì)粒選擇
PCR反應(yīng)結(jié)束后使用Mutazyme™酶消化甲基化質(zhì)粒從而選擇突變質(zhì)粒DNA。
1. 準(zhǔn)備PCR反應(yīng)產(chǎn)物
2. 加入1μl（10U/μl）Mutazyme™酶37℃溫育1小時(shí)。
[注]當(dāng)質(zhì)粒DNA用量過(guò)多時(shí)Mutazyme™酶可能發(fā)生與樣品反應(yīng)不完全的現(xiàn)象。因此我們建議為了保證突變率請(qǐng)嚴(yán)格遵照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作。如果突變率低，可以適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間或增加Mutazyme™酶用量。
[C]轉(zhuǎn)化
反應(yīng)完畢后在質(zhì)粒DNA上會(huì)產(chǎn)生缺口，當(dāng)把這個(gè)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入E.coli中時(shí)請(qǐng)選擇dam+型菌株，例如DH5α。
1. 將10μl樣品加到50μl感受態(tài)細(xì)胞里，然后放置在冰上30分鐘。
2. 接下來(lái)可以參照一般的轉(zhuǎn)化步驟進(jìn)行。
序列分析
通常當(dāng)LB平板上出白色菌落則表明發(fā)生了突變。
為了證實(shí)這一結(jié)果，我們建議對(duì)白色單菌落進(jìn)行測(cè)序分析。
把目的基因上面的一個(gè)堿基換成另外一個(gè)堿基。
二、定點(diǎn)突變的原理
通過(guò)設(shè)計(jì)引物，并利用PCR將模板擴(kuò)增出來(lái)，然后去掉模板，剩下來(lái)的就是我們的PCR產(chǎn)物，在PCR產(chǎn)物上就已經(jīng)把這個(gè)點(diǎn)變過(guò)來(lái)了，然后再轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性克隆，再測(cè)序確定就行了。
三、引物設(shè)計(jì)原則
引物設(shè)計(jì)的一般原則不再重復(fù)。
突變引物設(shè)計(jì)的特殊原則：
（1）通常引物長(zhǎng)度為25~45 bp，我們建議引物長(zhǎng)度為30~35 bp。一般都是以要突變的堿基為中心，加上兩邊的一段序列，兩邊長(zhǎng)度至少為11-12 bp。若兩邊引物太短了，很可能會(huì)造成突變實(shí)驗(yàn)失敗，因?yàn)橐镏辽僖?1-12個(gè)bp才能與模板搭上，而這種突變PCR要求兩邊都能與引物搭上，所以?xún)蛇呑詈酶髟O(shè)至少12個(gè)bp，并且合成多一條反向互補(bǔ)的引物。
（2）如果設(shè)定的引物長(zhǎng)度為30 bp，接下來(lái)需要計(jì)算引物的Tm值，看是否達(dá)到78℃（GC含量應(yīng)大于40%）。
（3）如果Tm值低于78℃，則適當(dāng)改變引物的長(zhǎng)度以使其Tm值達(dá)到78℃（GC含量應(yīng)大于40%）。
（4）設(shè)計(jì)上下游引物時(shí)確保突變點(diǎn)在引物的中央位置。
（5）最好使用經(jīng)過(guò)純化的引物。
Tm值計(jì)算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5
注：L：引物堿基數(shù)；% of GC：引物GC含量。
四、引物設(shè)計(jì)實(shí)例
以GCG→ACG為例：
5’-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3’
（1）首先設(shè)計(jì)30 bp長(zhǎng)的上下游引物，并將A (T)設(shè)計(jì)在引物的中央位置。
Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3’
Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3’
（2）引物GC含量為40%，L為30，將這兩個(gè)數(shù)值帶入Tm值計(jì)算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。通過(guò)計(jì)算可以看出其Tm低于78℃，這樣的引物是不合適的，所以必須調(diào)整引物長(zhǎng)度。
（3）重新調(diào)整引物長(zhǎng)度。
Primer #1: 5’-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3’
Primer #2: 5’-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3’
在引物兩端加5mer（斜體下劃線處），這樣引物的GC含量為45.7%，L值為35，將這兩個(gè)數(shù)值帶入Tm值計(jì)算公式，得到其Tm為80.952（Tm=0.41×47.5-675/35+81.5），這樣的引物就可以用于突變實(shí)驗(yàn)了。
五、突變所用聚合酶及Buffer
引物和質(zhì)粒都準(zhǔn)備好后，當(dāng)然就是做PCR嘍，不過(guò)對(duì)于PCR的酶和buffer，不能用平時(shí)的，我們做PCR把整個(gè)質(zhì)粒擴(kuò)出來(lái)，延伸長(zhǎng)度達(dá)到幾個(gè)K，所以要用那些GC buffer或擴(kuò)增長(zhǎng)片段的buffer，另外，要用保真性能較好的PFU酶來(lái)擴(kuò)增，防止引進(jìn)新的突變。
除了使用基因定點(diǎn)突變?cè)噭┖�，如Stratagene和塞百盛的試劑盒，但價(jià)格昂貴。可以使用高保真的聚合酶，如博大泰克的金牌快速taq酶、Takara的PrimeSTARTM HS DNA polymerase。
六、如何去掉PCR產(chǎn)物
最簡(jiǎn)單的方法就是用DpnI酶，DpnI能夠識(shí)別甲基化位點(diǎn)并將其酶切，我們用的模板一般都是雙鏈超螺旋質(zhì)粒，從大腸桿菌里提出來(lái)的質(zhì)粒一般都被甲基化保護(hù)起來(lái)（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR產(chǎn)物都是沒(méi)有甲基化的，所以DpnI酶能夠特異性地切割模板（質(zhì)粒）而不會(huì)影響PCR產(chǎn)物，從而去掉模板留下PCR產(chǎn)物，所以提質(zhì)粒時(shí)那些菌株一定不能是甲基化缺陷株。
DpnI處理的時(shí)間最好長(zhǎng)一點(diǎn)，最少一個(gè)小時(shí)吧，最好能有兩三個(gè)小時(shí)，因?yàn)槿绻０逄幚淼貌桓蓛�，哪怕只有那么一點(diǎn)點(diǎn)，模板直接在平板上長(zhǎng)出來(lái)，就會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。
七、如何拿到質(zhì)粒
直接把通過(guò)DpnI處理的PCR產(chǎn)物拿去做轉(zhuǎn)化就行了，然后再篩選出陽(yáng)性克隆，并提出質(zhì)粒，拿去測(cè)序，驗(yàn)證突變結(jié)果。
八、圖示
九、定點(diǎn)突變操作步驟
[A] 誘導(dǎo)突變基因（PCR反應(yīng)）以待突變的質(zhì)粒為模板，用設(shè)計(jì)的引物及Muta-direct™酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，誘導(dǎo)目的基因突變。
1. 設(shè)計(jì)點(diǎn)突變引物。
[注]參考引物設(shè)計(jì)指導(dǎo)
2. 準(zhǔn)備模板質(zhì)粒DN A
[注]用dam+型菌株（例如DH5α菌株）作為宿主菌。在end+型菌株中常有克隆數(shù)低的現(xiàn)象，但是對(duì)突變效率沒(méi)有影響。提取質(zhì)粒DNA時(shí)我們建議您使用本公司的質(zhì)粒提純?cè)噭┖小?/span>
3. [選項(xiàng)]對(duì)照反應(yīng)體系（50μl反應(yīng)體系）
10×Reaction Buffer 5μl
pUC18 control plasmid（10ng/μl，total 20ng） 2μl
Control primer mix（20pmol/μl） 2μl
dNTP mixture（each 2.5mM） 2μl
dH2O 38μl
Muta-direct™ Enzyme 1μl
4. 樣品反應(yīng)體系（50μl反應(yīng)體系）
10×Reaction Buffer 5μl
Sample plasmid（10ng/μl，total 20ng） 2μl
Sample primer (F)（10pmol/μl） 1μl
Sample primer (R)（10pmol/μl） 1μl
dNTP mixture（each 2.5mM） 2μl
dH2O 38μl
Muta-direct™ Enzyme 1μl
5. PCR反應(yīng)條件
[注]按如下參數(shù)設(shè)置PCR擴(kuò)增條件。
Cycles Temperature Reaction Time
1cycle 95℃ 30sec
15cycle 95℃ 30sec
55℃ 1min
72℃ 1min per plasmid Kb
6. PCR擴(kuò)增反應(yīng)完成后冰育5分鐘，然后置于室溫（避免反復(fù)凍融）。
[注] 按下列提供的PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增，控制PCR循環(huán)數(shù)。注意當(dāng)突變點(diǎn)位點(diǎn)超過(guò)4個(gè)時(shí)會(huì)發(fā)生突變率降低的現(xiàn)象。
Mutation Cycles
1~2Nucleotide 15cycles
3Nucleotides 18cycles
[B] 突變質(zhì)粒選擇
PCR反應(yīng)結(jié)束后使用Mutazyme™酶消化甲基化質(zhì)粒從而選擇突變質(zhì)粒DNA。
1. 準(zhǔn)備PCR反應(yīng)產(chǎn)物
2. 加入1μl（10U/μl）Mutazyme™酶37℃溫育1小時(shí)。
[注]當(dāng)質(zhì)粒DNA用量過(guò)多時(shí)Mutazyme™酶可能發(fā)生與樣品反應(yīng)不完全的現(xiàn)象。因此我們建議為了保證突變率請(qǐng)嚴(yán)格遵照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作。如果突變率低，可以適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間或增加Mutazyme™酶用量。
[C]轉(zhuǎn)化
反應(yīng)完畢后在質(zhì)粒DNA上會(huì)產(chǎn)生缺口，當(dāng)把這個(gè)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入E.coli中時(shí)請(qǐng)選擇dam+型菌株，例如DH5α。
1. 將10μl樣品加到50μl感受態(tài)細(xì)胞里，然后放置在冰上30分鐘。
2. 接下來(lái)可以參照一般的轉(zhuǎn)化步驟進(jìn)行。
序列分析
通常當(dāng)LB平板上出白色菌落則表明發(fā)生了突變。
為了證實(shí)這一結(jié)果，我們建議對(duì)白色單菌落進(jìn)行測(cè)序分析。
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