組織切片
更新：2015-10-5 21:19:31 點(diǎn)擊：
介紹
組織切片
免疫組化（IHC）是應(yīng)用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原，對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究一種技術(shù)。
免疫熒光（IF）是采用熒光素標(biāo)記的已知抗體作為探針，檢測(cè)待測(cè)組織、細(xì)胞標(biāo)本中的靶抗原，形成的抗原抗體復(fù)合物上帶有熒光素，在熒光顯微鏡下，由于受高壓汞燈光源的紫外光照射，熒光素發(fā)出明亮的熒光，這樣就可以分辨出抗原（或抗體）的所在位置及其性質(zhì)，以達(dá)到對(duì)抗原物質(zhì)定位、定性、定量測(cè)定的目的。
免疫組化主要步驟
1.
包埋組織:
先在鐵模具中加入一些液態(tài)石蠟，先稍微冷卻，然后再將待包埋的組織置于石蠟之中，并排列整齊，再將塑料模具盒蓋上，最后加入少許液體石蠟，進(jìn)行冷凍，使石蠟變成固態(tài)。
2.
切片：
將包埋好的組織從模具上取下來(lái)，并置于石蠟切片機(jī)上，切片機(jī)通過(guò)調(diào)節(jié)上下左右來(lái)來(lái)使組織和切割方向一致，然后調(diào)節(jié)切片的厚度，一般為5μm,如果比較難切，則可以適當(dāng)調(diào)整厚度，用毛筆將切割的載玻片向外拉，并用小鑷子將包含有完整組織的載玻片置于40°C溫水中。
3.
脫蠟：
依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脫蠟作用的主要是二甲苯,依據(jù)的是相似相溶的原理.一般在每個(gè)試劑中放10min,天氣熱可以少放幾分鐘,相反,天氣較冷的話,就要適當(dāng)延長(zhǎng)脫蠟時(shí)間,一般為12-15min.
4.
抗原修復(fù)：
脫蠟后在清水中沖洗一段時(shí)間，加入3%H2O2浸泡10min，從而除去內(nèi)源性的過(guò)氧化氫酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗兩次，再加入檸檬酸緩沖液，放入微波爐中蒸煮3min（中火），一般剛到沸騰即可，冷卻至室溫，然后再蒸煮一次，冷卻至室溫，蒸煮的目的是為了使抗原的位點(diǎn)暴露出來(lái)。
5.
加一抗：
將溫箱中的載玻片取出，用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周?chē)难澹右豢�，如果做�?duì)照實(shí)驗(yàn)，就在對(duì)照的組織上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存過(guò)夜。
6.
加二抗：
將載玻片從冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周?chē)腜BS后加上二抗,然后置于37°C溫箱中半小時(shí)。
7.
加SABC:
將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周?chē)腜BS后加上SABC,
然后置于37°C溫箱中半小時(shí)。SABC稀釋100倍（990μlPBS：10μlSABC）。
8.
加顯色劑：
將片子從溫箱中取出,放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周?chē)腜BS后加上顯色劑。（顯色劑的配置：在1ml水中加1滴顯色劑A，搖勻，然后加1滴顯色劑B，搖勻，再加1滴顯色劑C，搖勻）A：DABB：H2O2
C：磷酸緩沖液
9.
復(fù)染：
將顯色后的片子用清水沖洗一段時(shí)間后，浸泡于蘇木精中染色，一般動(dòng)物組織為半分鐘，植物組織3-5min。
10.
脫水：
將復(fù)染后的片子置于水中沖洗后，依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每個(gè)試劑中放置2min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通風(fēng)柜中
11.
封片：
用中性樹(shù)膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上，要先放平一側(cè)，然后輕輕放下另一側(cè)，以免產(chǎn)生氣泡，封好片子后置于通風(fēng)柜中晾干。
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