介紹
組織切片
免疫組化(IHC)是應(yīng)用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理,通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原,對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究一種技術(shù)。
免疫熒光(IF)是采用熒光素標(biāo)記的已知抗體作為探針,檢測(cè)待測(cè)組織、細(xì)胞標(biāo)本中的靶抗原,形成的抗原抗體復(fù)合物上帶有熒光素,在熒光顯微鏡下,由于受高壓汞燈光源的紫外光照射,熒光素發(fā)出明亮的熒光,這樣就可以分辨出抗原(或抗體)的所在位置及其性質(zhì),以達(dá)到對(duì)抗原物質(zhì)定位、定性、定量測(cè)定的目的。
免疫組化主要步驟
1.
包埋組織:
先在鐵模具中加入一些液態(tài)石蠟,先稍微冷卻,然后再將待包埋的組織置于石蠟之中,并排列整齊,再將塑料模具盒蓋上,最后加入少許液體石蠟,進(jìn)行冷凍,使石蠟變成固態(tài)。
2.
切片:
將包埋好的組織從模具上取下來(lái),并置于石蠟切片機(jī)上,切片機(jī)通過(guò)調(diào)節(jié)上下左右來(lái)來(lái)使組織和切割方向一致,然后調(diào)節(jié)切片的厚度,一般為5μm,如果比較難切,則可以適當(dāng)調(diào)整厚度,用毛筆將切割的載玻片向外拉,并用小鑷子將包含有完整組織的載玻片置于40°C溫水中。
3.
脫蠟:
依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精,起脫蠟作用的主要是二甲苯,依據(jù)的是相似相溶的原理.一般在每個(gè)試劑中放10min,天氣熱可以少放幾分鐘,相反,天氣較冷的話,就要適當(dāng)延長(zhǎng)脫蠟時(shí)間,一般為12-15min.
4.
抗原修復(fù):
脫蠟后在清水中沖洗一段時(shí)間,加入3%H2O2浸泡10min,從而除去內(nèi)源性的過(guò)氧化氫酶,然后倒掉H2O2,在清水中洗兩次,再加入檸檬酸緩沖液,放入微波爐中蒸煮3min(中火),一般剛到沸騰即可,冷卻至室溫,然后再蒸煮一次,冷卻至室溫,蒸煮的目的是為了使抗原的位點(diǎn)暴露出來(lái)。
5.
加一抗:
將溫箱中的載玻片取出,用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周?chē)难澹右豢,如果做?duì)照實(shí)驗(yàn),就在對(duì)照的組織上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存過(guò)夜。
6.
加二抗:
將載玻片從冰箱中取出,放入PBS中洗3次,每次5min,擦干組織周?chē)腜BS后加上二抗,然后置于37°C溫箱中半小時(shí)。
7.
加SABC:
將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次,每次5min,擦干組織周?chē)腜BS后加上SABC,
然后置于37°C溫箱中半小時(shí)。SABC稀釋100倍(990μlPBS:10μlSABC)。
8.
加顯色劑:
將片子從溫箱中取出,放入PBS中洗3次,每次5min,擦干組織周?chē)腜BS后加上顯色劑。(顯色劑的配置:在1ml水中加1滴顯色劑A,搖勻,然后加1滴顯色劑B,搖勻,再加1滴顯色劑C,搖勻)A:DABB:H2O2
C:磷酸緩沖液
9.
復(fù)染:
將顯色后的片子用清水沖洗一段時(shí)間后,浸泡于蘇木精中染色,一般動(dòng)物組織為半分鐘,植物組織3-5min。
10.
脫水:
將復(fù)染后的片子置于水中沖洗后,依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每個(gè)試劑中放置2min,最后浸泡在二甲苯中,搬到通風(fēng)柜中
11.
封片:
用中性樹(shù)膠滴在組織旁邊,再用蓋玻片蓋上,要先放平一側(cè),然后輕輕放下另一側(cè),以免產(chǎn)生氣泡,封好片子后置于通風(fēng)柜中晾干。
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